این ستونی است که در واقع جداسازی نمونه در آن انجام می شود.

بستر ثابت ماهیتی به شدت قطبی دارد و فاز متحرک غیر قطبی است. بنابراین، نمونه‌های قطبی در سطح قطبی ستون به مدت طولانی‌تر از مواد قطبی کمتر باقی می‌مانند. برای نمونه های حساس به آب، آنالیت هایی که در آب نامحلول هستند، ایزومرهای هندسی خاصی که جداسازی آنها با فاز معکوس دشوار است و جداسازی طبقاتی خوب است. حلال‌های آلی مورد استفاده در جداسازی‌های فاز معمولی نسبت به برخی از بافرهای معمولی که در HPLC استفاده می‌شوند، سازگاری بیشتری با طیف‌سنجی جرمی (MS) دارند. در HPLC فاز معکوس، شرایط عملیاتی گاهی اوقات باید به طور چشمگیری اصلاح شود تا امکان سازگاری با تشخیص MS فراهم شود.

یک ماده همگن با ساختار مولکولی تصادفی مایع (غیر کریستالی). فرآیند تولید مستلزم آن است که مواد خام تا دمای کافی برای تولید یک مذاب کاملا ذوب شده حرارت داده شوند، که وقتی به سرعت سرد می شود، بدون کریستال شدن سفت می شود.