هموسیتومتر
به روز رسانی شده در ۱۴۰۳/۱۰/۱۸ زمان مطالعه 10 دقیقه
هموسیتومترها دستگاه های شمارش سلولی هستند که تراکم سلولی را در نمونه های مایع تعیین می کنند. استفاده از آنها در میکروبیولوژی، کشت سلولی و سایر کاربردهایی که نیاز به محاسبه غلظت سلولی دارند، مانند آنالیز مایع منی، رایج است.
نمایش تمام سازندگان هموسیتومتر
یک هموسیتومتر دارای یک اسلاید میکروسکوپی ساخته شده از شیشه ضخیم با دو محفظه با عمق دقیق است که توسط یک فرورفتگی مستطیل شکل تشکیل شده است. خطوط عمود بر روی محفظه، شبکه ای را با سطح مشخصی تشکیل می دهند.
برای محاسبه چگالی سلولی یک نمونه مایع، کاربر باید تعداد سلول ها یا ذرات دیگری را که باید در محفظه شمارش شوند، بداند. لبه های برآمده در اطراف محفظه ها به عنوان تکیه گاه نصب برای شیشه پوششی به نام پوشش پوششی عمل می کند که در بالای نمونه در ارتفاع دقیق 0.1 میلی متر قرار می گیرد.
انواع
هموسیتومترها دارای طراحی استاندارد مناسب برای عملکردهای متعدد هستند. با این حال، انواع متعددی با عمق و فاصله شبکه ای غیر استاندارد برای انواع و اندازه های مختلف سلول وجود دارد. به عنوان مثال، هموسیتومترهای تخصصی در جمع آوری سلول های اسپرم به دلیل اندازه کوچکتر سلول ها استفاده می شود.
عملیات
قسمت بیرونی محفظه شمارش و روکش ابتدا با استفاده از کاغذ لنز تمیز می شود. روکش‌های طراحی‌شده برای این دستگاه‌ها ضخیم‌تر از لام‌های مورد استفاده در میکروسکوپ معمولی هستند، زیرا باید به اندازه کافی مقاوم باشند تا در برابر کشش سطحی سیالات مقاومت کنند. ورقه پوششی قبل از معرفی نمونه روی محفظه قرار می گیرد.
مقدار کمی از مایع حاوی سلول ها بین لبه لغزش و محفظه اعمال می شود تا نمای بیرونی آینه شده را بپوشاند. محفظه شمارش بارگذاری شده در زیر میکروسکوپ با تنظیم بزرگنمایی برای تمایز سلولی کارآمد مشاهده می شود. این اجازه می دهد تا محاسبه انجام شود.
هنگام مشاهده یک هموسیتومتر استاندارد با الگوی حاکم Neubauer، کل شبکه در 40x (4x هدف) قابل مشاهده است. این شبکه به 9 مربع تقسیم می شود که هر کدام دارای مساحت سطحی میلی متر مربع و محفظه ای به عمق 0.1 میلی متر است.
آماده سازی
مایع نگهدارنده سلول ها قبل از قرار دادن روی هموسیتومتر آماده می شود. مخلوط باید یک سوسپانسیون همگن باشد تا از تجمع سلول ها جلوگیری شود و از توزیع یکنواخت اطمینان حاصل شود.
غلظت سلولی متوسط در مایع نمونه برای نتایج بهینه ترجیح داده می شود. غلظت بیش از حد باعث همپوشانی سلول ها می شود و جمع آوری آنها را دشوار می کند.
سطوح ناکافی غلظت با چند سلول در هر مربع منجر به نسبت خطای آماری بالاتر می شود. این امر نیاز به شمارش مربع های بیشتری دارد و در نتیجه روند را طولانی تر می کند.
یکی از روش های به حداقل رساندن خطاهای آماری و بهبود دقت شمارش، تعیین غلظت سلول ها در هر میلی لیتر با استفاده از اندازه گیری از دو مربع مجزا است. یک انحراف عمده ممکن است به خطا در نمونه گیری اشاره کند.
تمایز
رقیق‌سازی با استفاده از رنگ زنده، تمایز بین سلول‌های مرده و سلول‌های زنده را در زیر میکروسکوپ امکان‌پذیر می‌سازد. سلول های مرده رنگ را جذب می کنند و به رنگ خاصی تغییر می کنند در حالی که سلول های زنده بدون رنگ باقی می مانند. آزمایشی با استفاده از محفظه دوم برای تأیید صحت نتیجه اولیه انجام می شود. نتایج متفاوت می‌تواند نشان‌دهنده نقص در فرآیند دنبال‌شده باشد.
محاسبه تراکم سلولی
برای اکثر برنامه ها، تنها چهار مربع گوشه بزرگ و مربع مرکزی در نظر گرفته می شود. هنگامی که سلول ها روی یک خط می افتند، رویه های خاصی اعمال می شود. سلول‌هایی که خطوط بالا و راست مربع را لمس می‌کنند شمارش نمی‌شوند، در حالی که سلول‌هایی که در سمت چپ و پایین قرار دارند شمارش می‌شوند. سلول های متحرک، مانند سلول های اسپرم، باید قبل از شروع فرآیند بی حرکت شوند.
هنگام محاسبه تراکم سلولی، شاخص های زیر برای بدست آوردن تعداد دقیق سلول در 1 میلی لیتر محلول مورد نیاز است:
تعداد سلول ها در یک مربع
ارتفاع نمونه
فاکتور رقیق سازی
مساحت میدان
پس از مشخص شدن این مقادیر، مراحل زیر به کار گرفته می شود:
میانگین‌گیری : مگر اینکه تمام سلول‌های یک مربع بزرگ‌تر شمارش شده باشند، نتایج باید قبل از ادامه مرحله بعدی میانگین‌گیری شوند.
محاسبه حجم : برای محاسبه حجم مربع، عرض و ارتفاع مربع در ارتفاع نمونه ضرب می شود.
تعیین تعداد سلول در 1 میلی لیتر : از روش نسبت مستقیم برای محاسبه این مقدار از اعداد به دست آمده در مراحل قبل استفاده می شود.
تنظیم برای رقت : هنگامی که یک نمونه قبل از شمارش رقیق می‌شود، باید برای منعکس کردن آن، تنظیماتی در شمارش نهایی انجام شود.
برنامه های کاربردی
هموسیتومترها عملکردهای مختلفی را انجام می دهند، مانند انجام شمارش سلول های خون و کشت سلول ها در محیط آزمایشگاهی که محلول حاوی مواد مغذی نیاز به تجدید دوره ای دارد.
کشت سلولی اغلب در تهیه مخمر برای تخمیر آبجو استفاده می شود. هموسیتومترها در اندازه‌گیری اندازه سلول و پردازش سلول برای آنالیز (PCR، فلوسیتومتری) مفید هستند.
انتخاب هموسیتومتر
هنگام انتخاب هموسیتومتر، ویژگی های هزینه و عملکرد باید با استفاده مورد نظر سنجیده شود. در صورت ماهیت بسیار خاص برنامه، به خرید یک دستگاه تخصصی، به جای یک دستگاه عمومی، فکر کنید.
استانداردها
ASTM F2149 - روش تست استاندارد برای تجزیه و تحلیل خودکار سلول ها - روش ناحیه حسگر الکتریکی برای شمارش و اندازه سوسپانسیون های تک سلولی.
منبع